1写在前面

不知道大家都是怎么完成qPCR的计算的，在不会R的时候，我是用一个祖传的Excel表进行计算的。🤣
但是，一直有个缺点，如果需要计算的量比较大时，就不方便了，去搜了一下文献，发现了一个最近发表的R包，不仅可以计算反转录的RNA体积，还可以帮助选择定量方法，简直是神仙R包，本期就介绍一下它的使用吧。🥰
感谢原作者的开发，嘿嘿，文末有引用方法。👀

2用到的包

rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(ggsci)
library(qPCRtools)
library(ggstatsplot)

3计算反转录用的RNA体积

3.1 示例数据

包内自带了示例数据，这里我们就直接加载吧。🥳
df.1需要至少2列，sample和concentration，剩下的大家随意。🤣
Note! 这里浓度默认是ng/ul。🤜

df.1.path <- system.file("examples", "crtv.data.txt", package = "qPCRtools")

df.1 <- data.table::fread(df.1.path)

head(df.1)

Note! 这里我们的df.2文件至少要包含一个all的列，告诉R具体的反应体积。🤒

df.2.path <- system.file("examples", "crtv.template.txt", package = "qPCRtools")

df.2 <- data.table::fread(df.2.path)

head(df.2)

3.2 开始计算

现在我们就知道每个sample该如何配置反转路体积啦，Perfect!😁
这里我们假设反转1ug。🤩

result <- CalRTable(data = df.1, template = df.2, RNA.weight = 1)

head(result)

4相对标准曲线和扩增效率的计算

拿到新的Primers应该先进行扩增效率的计算，一起看下怎么弄吧。👇

4.1 示例数据

df.1包含至少2列，孔的位置和Cq值。😗

df.1.path <- system.file("examples", "calsc.cq.txt", package = "qPCRtools")

df.1 <- data.table::fread(df.1.path)

head(df.1)

df.2包含至少2列，孔的位置和浓度。🫠

df.2.path <- system.file("examples", "calsc.info.txt", package = "qPCRtools")

df.2 <- data.table::fread(df.2.path)

head(df.2)

4.2 开始计算

Note! 大家注意一下这里的稀释倍数，默认是4，可以按需更改。😂

CalCurve(
  cq.table = df.1,
  concen.table = df.2,
  lowest.concen = 4,
  highest.concen = 4096,
  dilu = 4,
  by = "mean"
) -> p

p[["table"]]

4.3 可视化

p[["figure"]] +
  theme_bw()+
  scale_color_npg()

5使用相对标准曲线法计算基因表达水平

如果内参基因和目的基因的扩增效率不相等，我们就不能使用2-ΔΔCt法了，需要选择无参的方法。🤨

5.1 示例数据

cq.table至少包含position和Cq值。😘

df1.path <-  system.file("examples", "cal.exp.curve.cq.txt", package = "qPCRtools")

cq.table <-  data.table::fread(df1.path)

head(cq.table)

curve.table为标准曲线，可以通过前面介绍的方法计算得出。😂

df2.path = system.file("examples", "cal.expre.curve.sdc.txt", package = "qPCRtools")

curve.table = data.table::fread(df2.path)

head(curve.table)

design.table需要包含position和相应的信息，如干预、基因名等。 🙃

df3.path = system.file("examples", "cal.exp.curve.design.txt", package = "qPCRtools")

design.table = data.table::fread(df3.path)

head(design.table)

5.2 开始计算

CalExpCurve(
  cq.table,
  curve.table,
  design.table,
  correction = TRUE,
  ref.gene = "OsUBQ",
  stat.method = "t.test",
  ref.group = "CK",
  fig.type = "box",
  fig.ncol = NULL) -> res

res[["table"]]

5.3 可视化

大家可以直接使用res[["figure"]]提取结果的可视化图，这里我为了更加美观，提取了数据进行美化。😘

res[["table"]] %>% 
  grouped_ggbetweenstats(y = expre,
                        x = Treatment,
                        grouping.var = Gene,
                        type = "nonparametric"
                         )

62-ΔΔCt法计算表达水平

数据准备与上面的方法相似，这里就不做具体介绍了。😂

6.1 示例数据

df1.path <-  system.file("examples", "ddct.cq.txt", package = "qPCRtools")

cq.table <-  data.table::fread(df1.path)

head(cq.table)

df2.path <-  system.file("examples", "ddct.design.txt", package = "qPCRtools")

design.table <-  data.table::fread(df2.path)

head(df.2)

6.2 开始计算

CalExp2ddCt(cq.table,
            design.table,
            ref.gene = "OsUBQ", ## 内参
            ref.group = "CK", ## 对照
            stat.method = "t.test", ## 统计方法
            fig.type = "bar",
            fig.ncol = NULL) -> res

res[["table"]]

6.3 可视化

res[["table"]] %>% 
  grouped_ggbetweenstats(y = expre,
                        x = Treatment,
                        grouping.var = gene,
                        type = "nonparametric"
                         )

7使用RqPCR方法计算表达水平

这种方法也是一种不需要内参的计算方法，数据格式也是几乎一样的。

7.1 示例数据

df1.path <- system.file("examples", "cal.expre.rqpcr.cq.txt", package = "qPCRtools")

cq.table <- data.table::fread(df1.path, header = TRUE)

head(cq.table)

df2.path <- system.file("examples", "cal.expre.rqpcr.design.txt", package = "qPCRtools")

design.table <- data.table::fread(df2.path, header = TRUE)

head(design.table)

7.2 开始计算

CalExpRqPCR(cq.table,
           design.table,
           ref.gene = NULL,
           ref.group = "CK",
           stat.method = "t.test",
           fig.type = "box",
           fig.ncol = NULL
           ) -> res


res[["table"]]

7.3 可视化

res[["table"]] %>% 
  grouped_ggbetweenstats(y = Expre4Stat,
                        x = group,
                        grouping.var = gene,
                        type = "nonparametric"
                         )

8引用

🌟 如何引用：👇

Li X, Wang Y, Li J, Mei X, Liu Y, Huang H. qPCRtools: An R package for qPCR data processing and visualization. Front Genet. 2022;13:1002704. Published 2022 Sep 13. doi:10.3389/fgene.2022.1002704

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰