引言

生物学实验中，常常需要设置重复，例如技术重复、生物学重复，以此确保不是个体的偶然变异对结果产生影响。以转录组数据为例，一般会设置3-5个生物学重复，如何确认生物学重复的效果好坏呢，方法有很多，可以计算两两样本之间的相关性，可以进行样本的PCA分析，或者绘制聚类热图，这里首先介绍样本相关性方法。
我们将在R，使用Rstudio进行计算绘图。

数据

转录组数据分析完成以后，我们会拿到基因表达矩阵，格式如下，行为基因，列为样本（也可以是行为样本，列为基因，在R中转置函数t()可以秒秒种搞定）。

计算相关系数

何谓相关？简单来说若你高我也高，你低我也低，或者你高我低都可以叫做相关。数理统计上通过计算相关系数来衡量，取值[-1, 1]，负数表示负相关，正数表示正相关。在显著性的前提下，绝对值越大，相关性越强。绝对值为0， 无线性关系；绝对值为1表示完全线性相关。有Pearson, Spearman和 Kendall 三类相关系数，它们的特点是：
| 相关系数 | 适用变量类型 |假设条件|
|–|–|–|–|
| Pearson | 连续变量|1.服从正态分布，2.两个变量的标准差不为0 |
| Spearman|连续变量/等级数据| 成对等级相关数据即可|
|Kendall|有序分类变量| 成对等级相关数据即可|
可以看到除了Pearson相关系数对数据有严格要求外，其他两种的适用范围都比较广，当你不确定数据分布时，一般适用Spearman即可。

这里要计算样本之间的相关性，落实到代码中，其实就是分别计算数据列与列之间的相关系数。

## 设置工作路径
setwd('/Users/yut/Desktop/data')

fpkm <- read.table('control_case_fpkm.txt', header = T, row.names = 1)	#header=T,第一行指定为列名，row.names=1指定第一列为行名
View(fpkm) #查看数据
## 计算样本之间的相关性

corr <- cor(fpkm, method = 'spearman')  #cor函数计算两两样本（列与列）之间的相关系数
View(corr)	#查看样本之间的相关系数

cor函数返回样本之间的相关系数矩阵，对角线为样本自身与自身的相关系数1，左下和右上半角是一样的

映射相关系数到热图

为了更直观的展示，使用corrplot将相关系数矩阵映射成热图

## 如果不存在corrplot就安装这个包
if (!requireNamespace('corrplot', quietly = TRUE))
  install.packages('corrplot')
library('corrplot')	#加载corrplot包用于绘制相关性矩阵热图
# corrplot并不能直接计算两两样本之间的相关系数，而需要通过R内置函数cor计算，corrplot真正做的是把cor计算得到的样本相关系数矩阵映射成不同的颜色和样式
# 映射成热图
corrplot(corr, type = 'upper', tl.col = 'black', order = 'hclust', tl.srt = 45, addCoef.col = 'white')	

# type='upper'：只显示右上角相关系数矩阵
# tl.col='black'：字体颜色黑色
# order='hclust'：使用层次聚类算法
# tl.srt = 45：x轴标签倾斜45度
# addCoef.col='white'：添加相关系数数值，颜色白色

Encode计划建议皮尔逊相关系数的平方(R²)大于0.92(理想的取样和实验条件下)。具体的项目操作中，一般要求生物学重复样品间R²至少要大于0.8，否则需要对样品做出合适的解释，或者重新进行实验。一般来说：

0.8-1.0 极强相关
0.6-0.8 强相关
0.4-0.6 中等程度相关
0.2-0.4 弱相关
0.0-0.2 极弱相关或无相关

从上面的结果看，case组内和control组内的相关系数都较高，而组间的相关系数都较低，说明生物学重复效果好，可以继续后续分析。若组内某个样本与同组内其他样本的相关系数都较低，则可以考虑去除，或者加测样本进行重分析

corrplot输入

# corrplot并不能直接计算两两样本之间的相关系数，而需要通过R内置函数cor计算，corrplot真正做的是把cor计算得到的样本相关系数矩阵映射成不同的颜色和样式
d <- data.frame(
  s1 = 1:3
  , s2 = c(1, 0, 4)
  , s3 = 5:7
)
corr <- cor(d)
> class(corr)
[1] "matrix" "array" 
> corr
          s1        s2        s3
s1 1.0000000 0.7205767 1.0000000
s2 0.7205767 1.0000000 0.7205767
s3 1.0000000 0.7205767 1.0000000
# 映射成热图
corrplot(corr, type = 'upper', tl.col = 'black', order = 'hclust', tl.srt = 45, addCoef.col = 'white')	

完整代码

# <样本相关性>
## 1.如果不存在corrplot就安装这个包
if (!requireNamespace('corrplot', quietly = TRUE))
  install.packages('corrplot')
library('corrplot')	#加载corrplot包用于绘制相关性矩阵热图
# corrplot并不能直接计算两两样本之间的相关系数，而需要通过R内置函数cor计算，corrplot真正做的是把cor计算得到的样本相关系数矩阵映射成不同的颜色和样式

## 2.读入基因fpkm的表达矩阵
##设置工作路径
setwd('/Users/yut/Desktop/data')

fpkm <- read.table('control_case_fpkm.txt', header = T, row.names = 1)	#header=T,第一行指定为列名，row.names=1指定第一列为行名
View(fpkm) #查看数据
##3.计算样本之间的相关性

corr <- cor(fpkm, method = 'spearman')  #cor函数计算两两样本（列与列）之间的相关系数
View(corr)	#查看样本之间的相关系数

# pdf('../sample_correlation.pdf', width = 8, height = 8)	#打开绘图设备，保存为pdf文件
corrplot(corr, type = 'upper', tl.col = 'black', order = 'hclust', tl.srt = 45, addCoef.col = 'white')	

# type='upper'：只显示右上角相关系数矩阵
# tl.col='black'：字体颜色黑色
# order='hclust'：使用层次聚类算法
# tl.srt = 45：x轴标签倾斜45度
# addCoef.col='white'：添加相关系数数值，颜色白色

# dev.off() #配合pdf（）使用，关闭绘图设备