生物信息学

生物信息学——基础篇：一至三代测序技术

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一、一代测序

• 概述：一代测序（又称Sanger测序）。

• 原理：Sanger测序利用一类特殊的核昔酸，即ddNTP (双脱氧核苷三磷酸)：这种核昔酸不能形成磷酸二酯键，故会中断DNA的延长。如果用同位素对ATCG四个碱基进行部分标记，电泳后通过放射显影就可以知道这4个碱基出现的位置。例如针对序列ATCGATCGATCG，对A作为终止标记。即可得到三类片段，即A，ATCGA，ATCGATCGA。因此分析可以知道碱基A出现在第1位，第5位和第9位。同样，如果用同样的方法对其他碱基进行标记，也可以测定其余碱基的位置，最终获得待测序列的碱基顺序。

• 过程：
  

• 优点：操作简单，误差小。

• 缺陷：成本高，通量低，一次只能测一条DNA，而且测序长度有限（至多约为1000bp）。

二、二代测序

• 概述：二代测序（又名高通量测序），主要是为了解决一代测序长度限制，且通量低效率低的问题而开发。目前，二代测序（主要为Illumina测序仪）是市场主流。
• 原理：将长的DNA（或者RNA反转录的cDNA）进行碎片化（鸟枪法），之后利用接头将片段化的DNA固定在不同材质的表面。之后进行桥式PCR形成簇状结构，该过程扩增了DNA，相当于放大了信号强度。之后使用不同荧光基团对4种碱基进行标记，就可以根据荧光信号确认新合成的DNA单链时连接上去的碱基。
• 过程：
• 文库构建：即为测序片段添加接头。无论是PCR产生的片段还是基因组鸟枪法打断的片段都具有特异性（PCR中不同样品反向引物插入了特异性的barcode，因此两端也是特异的），两端缺乏必要的引物因此混合DNA片段不能直接扩增和测序。DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建。
  ①末端修饰。目前很多PCR使用的高保真Pfu聚合酶产生的片段末端是平齐的（也即没有不配对的碱基）；鸟枪法产生的片段则是随机断裂，其末端可能是平齐的也可能是不平的。因此，建库第一步是使用Taq聚合酶补齐不平的末端，并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰），产生粘性末端的片段可以添加接头（Adaptor）。
  ②添加接头。经过末端修饰后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端。NEB的接头为特殊的碱基U连接的环状结构（可以增强稳定性），因此连接接头后，还需要将碱基U删除从而形成“Y”形接头。这一步添加的接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增继续添加文库index和与测序平台互补的寡核苷酸序列（此外还作为测序引物Rd1 SP/Rd2 SP），而之所以为“Y”型开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列（每一端都是Rd1 SP与Rd2 SP交错），因为连接酶没有选择性，每个接头都是只靠突出的T来与DNA连接，“Y”接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而在后续PCR中可以连接不同的寡核苷酸序列（P5/P7），（每个DNA短片段的正链与反链都加上了P5与P7，因此建库后每个DNA片段都会扩增出两种结果）具体流程见下图。
  

③磁珠纯化。添加接头后的文库体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶以及辅助物质，接头的添加也是过量的，而且由于末端的不稳定性，容易形成自连片段，鸟枪法打断的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）纯化来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段。其原理为磁珠可以通过氢键等作用力来吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力，但其储存的buffer里面含有20%的PEG 8000，PEG浓度越大则可以吸附的DNA片段越小。因此磁珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制磁珠添加量（其实是PEG添加量）来实现片段选择。
④PCR扩增。添加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来扩增。这个过程非常重要，因为目前所有片段其两端是不互补的Y形结构，不能直接进行测序；此外，片段还需要添加用于区分不同文库的特异性index，以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列（P5/P7）。
⑤第二次磁珠纯化。PCR后需要将产物DNA片段与聚合酶等杂质分离，因此再次进行磁珠纯化，之后进行质量检测，包括DNA浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。测序是以单链为单位的，建库完成后的每条DNA的单链均一端连有测序引物Read1 Sequencing Primer（Rd1SP）和P5，另一端为Rd2 SP、Index（Barcode）和P7。Index用来区分不同的文库，因为测序仪一个run产生数据量巨大，由于实际情况不同，一次上机常会进行多个文库测序，因此需要加上Index来区分。

• 上机测序：
  Illumina测序技术为基于基因芯片的边合成边测序，整个平台可解剖为三个系统：一温度控制系统，原理和普通PCR仪一样，来控制反应的进行；二酶控制系统，通过各种酶来控制DNA合成与剪切；三荧光信号收集系统，可以理解为分辨率极高的照相机。在Illumina测序平台的流通池（Flow cell）表面，通过基因芯片技术交错固定了无数条寡核苷酸链（即短核苷酸链），分别为P5’(P5互补)和P7，单链化的文库DNA片段进入流通池后，包含P5或P7’的单链可以与表面的寡核苷酸基于互补配对结合，从而进入测序过程。测序具体流程如下：
  ①首先以寡核苷酸为引物、文库片段为模板进行DNA复制（因为文库稀释后浓度足够低，可以认为文库片段均匀的结合在流通池表面，每个片段结合的位置相距足够远，这很重要，否则测序时会导致信号叠加而不能识别）。复制完成后解链，将文库片段洗去，留在流通池表面的为与文库模板互补的DNA链。
  ②因为单链DNA另一端为不同的接头序列，可以与相邻的另一种寡核苷酸互补结合，之后进行“桥”式扩增（假如第一次结合的为P7，则复制完成洗脱模板后顶端可以与相邻的P5互补结合形成“桥”，并以P5为引物进行复制，完成后再次解链并与相邻不同种接头结合来进行复制，如此类推）。25-28个循环完成后，原来散布在表面的单核苷酸序列变成散布的DNA簇，这一步主要是为后续测序做准备，因为测序时单分子产生的光信号很弱，难以检测。
  

③“桥”式扩增后一个DNA簇都是由最初的一个文库模板复制而来，但是这时候P7上的序列与P5上的序列是分别从两端开始的，测序要保证每个片段一致性（都是正向或都是反向），因此再次解链线性化，切割并洗去P5上的DNA链，只留P7上的DNA单链。Illumina巧妙地利用了甲酰胺基嘧啶糖苷酶Fpg对8-氧鸟嘌呤糖苷8-oxo-G的选择性切断作用，在合成的引物链上加入了一个8-oxo-G，用Fpg处理，就把带8-oxo-G基团切掉，并把DNA链切断，留下一带不完整糖基的磷酸基。这个磷酸基在接下来的过程中，起到了阻止P5延伸的作用。此后的双末端测序中需要恢复3’-OH，则用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶AP-endonuclease把带不完整糖基的那个磷酸基切掉。
④加入测序引物Read1 SP和修饰过的DNA聚合酶，则在测序引物3’端开始DNA复制。在流通池加入可逆终止荧光dNTP，其3’-OH被阻隔（糖基3’连接有叠氮基团，在链延伸时起到了阻止添加下一个dNTP作用，因此在除去阻隔前只能添加一个碱基），4种dNTP在碱基上分别连接有不同颜色的荧光基团（也可以相同颜色荧光标记，但是测序会更慢，每次只能添加一种碱基）。之后洗掉多余的dNTP，使用激光扫描，收集留在流通池表面的荧光信号（如图1-6所示）。用巯基试剂去掉3’位阻断的叠氮基团，用TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,三(2-羧乙基)膦)去掉荧光基团，进入下一个碱基的测序反应。因为每条DNA单链扩增形成的DNA簇均固定在表面，随着反应进行根据相同位置出现的荧光信号情况，就逐渐读出了改位点DNA链的序列。
⑤要保证测序的准确性，需要一个位点DNA簇的每条链同步复制，然而随着反应进行，不同链复制情况会出现差异，因此二代测序读长目前限制在300bp以内。Read1结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测序引物Index引物（也即Read2 SP互补的寡核苷酸），这时会继续在3’端进行复制，读出接头中Index序列，从而可以确定出每个位点的DNA属于哪个文库。
⑥为了增长测序长度，进行另一个方向测序，也即双末端测序。洗掉前面复制合成的片段，DNA单链继续在流通池表面形成桥式连接，这时要用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶处理修复P5的3’-OH末端，加入聚合酶，则在P5末端开始DNA复制。十几个循环后，将P7上的DNA切割并洗掉。Illumina通过在P7核酸链中加入一个U碱基，用USER酶（Uracil Specific Excision Reagent，尿嘧啶链特定切断试剂）来切隔断链。这时只留下P5上的DNA链，与Read中方向相反。加入测序引物Read2 SP，进行另一端的序列读取。

• 测序数据：得到测序数据为fastq格式的碱基序列
• 优点：
  • 与第一代测序合成完进行电泳，显影最后得到结果相比，边合成边测序的测序效率得到极大提高。
  • 将长DNA片段化后，可以同时进行多个通道的测序，提高通量，减少时间。
• 缺陷：
  • 每一片段的读长较短（约为500bp）。
  • 进行长DNA测序时，需要对结果进行拼接，同样在边合成边测序的策略下，误差来源就是合成时碱基突变(GC突变等）。这就导致对于高度杂合的基因组、高度重复序列、高GC的区域、拷贝数变异等测序，往往不能利用二代测序准确获得。

三、三代测序

• 概述：三代测序（又名单分子测序），即理论上可以进行超长读长，不需要进行PCR扩增的测序。以SMRT (Pacific Biosciences）技术和Oxford Nanopore为代表。
• 原理：SMRT技术采用边合成边测序的思路，以及荧光检测的基本技术。
• 过程：SMRT中，碱基采用4种可断裂的荧光标记基团，当被DNA聚合酶合成到新生成的DNA链上时，荧光基团发生脱落，检测不同荧光脱落信号，即可获得序列。然而这一操作很容易被背景杂光干扰，因此该技术中还有一个重要组成部分就是零模波导孔，这是一个足够小的小孔(10nm) ,小到只能插入一个DNA聚合酶和一条DNA序列，因此在检测的时候可以不受到背景干扰，只探测到一条DNA的信号。
• 优点：
  • 超长读长（10kbp）
  • 样品用量极少
  • 适用于长片段和高度多样性的基因组
  • 测序速度快
• 缺陷：
  • 需要构建文库
  • 误差率比较高，需要多次测序来分析和降低误差。
• 原理：Oxford Nanopore技术即纳米孔技术，这一技术直接绕开了边合成边测序和荧光检测这两个传统思路。
• 过程：四种碱基由于有不同的结构，因此带电特点不同，通过纳米孔时引起的电流变化不同。通过测量电流变化来观测到不同分子穿过纳米孔。而通过分析ATCG四种碱基的特点，即可绘制测序结果图。其本质是检测变化的电信号。纳米孔的成分可以是生物纳米孔，即使用蛋白质镶嵌在膜上（Oxford Nanopore Technologies技术使用溶血素蛋白)，也可以是化学纳米孔，如石墨烯，高分子材料孔。
• 优点：
  • 理论上无读长限制
  • 不需要额外碱基，可以直接测定RNA，再也不用逆转录（都是检测电信号）
  • 样品用量极少
• 缺陷：
  • 误差比较大（长DNA可能在孔口出现缠绕，且过孔控制不好）

四、总结

• 一代技术，误差低，读长中等，但是速度慢，效率低。
• 二代技术读长短，但是可以同步进行多个片段测序，效率非常高。（目前主流测序技术）
• 三代测序读长超长，效率更高，且需要样品量极少(单分子)，但在目前发展阶段，误差比较高。